途中やりれぽーと
ワードそのままコピるからレイアウトはおかしいです
１． 目的
無機窒素が植物体の成長、葉組織、タンパク質あるいはCO2の固定酵素のレベルにどのような影響を及ぼすかを理解すること。
２． 方法･結果
１） 生長解析
あらかじめ生育させておいたトウモロコシの幼苗を用いる。幼苗の新鮮重量、草丈、寝の長さを記録し、幼苗には個体番号をつけておく。
これらの幼苗を完全栄養区と窒素要素欠除区になるように調製した２つの培養液でそれぞれ5本ずつ生育させる。完全栄養区をN+、窒素要素欠除区をN-とする。
トウモロコシの生長データ
5/30
N+
①
②
③
④
⑤
草丈(cm)
16
17
17
19
16
根(cm)
19
22
26
27
16
重さ(g)
1.5
1.9
2.5
2.4
1.8
N-
①
②
③
④
⑤
草丈(cm)
12.8
10
16
14.5
18.3
根(cm)
20.5
8
31
22
26
重さ(g)
1.5
1
2.1
1.5
2.5
6/5
N+
①
②
③
④
⑤
草丈(cm)
28
28
27
28
22
根(cm)
20
22
26
29
16
重さ(g)
3.3
3.3
4.1
3.9
1.8
N-
①
②
③
④
⑤
草丈(cm)
19
4
25
20
24
根(cm)
22
5
32
24
31
重さ(g)
1.7
0.1
1.7
1.7
2.9
また、新鮮重量と、植物体を封筒に入れて乾燥器中で乾燥させた後の乾燥重量も測定する。
6/13
新鮮重量
N+
①
②
葉(g)
4.97
4.25
根(g)
6.65
6.31
N-
①
②
葉(g)
0.9
―
根(g)
1.23
―
乾燥重量
N+
①
②
葉(g)
0.66
0.60
根(g)
0.35
0.44
N-
①
②
葉(g)
0.13
―
根(g)
0.13
―
２） 葉組織の顕微鏡観察
トウモロコシ(C4植物)とカランコエ(CAM植物)の葉断面を光学顕微鏡を用いて構造の違いを観察する。
フェザーナイフで葉を切り、葉切片をつくる。ニワトコに切れ目を入れ、これに葉切片をはさみニワトコごと葉切片を薄く切る。これでプレパラートを作り、光学顕微鏡で観察する。
C4植物であるトウモロコシにはクランツ構造が確認され、より維管束鞘細胞が発達しているとわかる。
３） タンパク質の定量
① タンパク質の検量線
標準タンパク質に牛血清アルブミンを用いて検量線を作成する。
まず牛血清アルブミン溶液(0.8mg/ml)を5段階に希釈する。
検量線作成に用いる標準タンパク質溶液の濃度
No.
1
2
3
4
5
牛血清アルブミン溶液(μl)
50
100
150
200
250
水(μl)
200
150
100
50
0
濃度(mg/ml)
0.16
0.32
0.48
0.64
0.80
これらの溶液にブラッドフォード溶液を3ml加え、590nmの吸光度を測定する。ブランクは水50μlにブラッドフォード3mlを加えたものとする。
ここで得た吸光度を使い、横軸にタンパク質の濃度、縦軸に吸光度をとり、検量線を書く。
② 葉のタンパク質量
各実験区のトウモロコシと、別に用意したツタ植物の葉片それぞれ0.2gを抽出用緩衝液(50mM Tris-HCl, pH7.5, 0.2mM EDTA, 5mM DTT)2ml、0.3gの海砂、およそ100mgのPolyclar ATとともに氷冷した乳鉢を用い磨砕し、ミラクロスでろ過する。各ろ液をメモリつきのスピッツグラスに移して測定する（①）。
各ろ液1mlをエッペンドルフチューブに移して10,000rpmで5分間遠心分離し、その上澄み液を得る。このうち、各上澄み液の100μlはポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)用に保存する。
こうして得た溶液を5倍に希釈(②)して、50μlとり、ブラッドフォード溶液3mlを加えて590nmの吸光度を測定する。この吸光度と検量線を用いて各資料の1g当たりに含まれるタンパク質の量を計算する。
資料1g当たりのタンパク質＝③×②×①×1.0/0.2
葉のタンパク質量
N+
N-
ツタ
吸光度
0.990
0.016
0.014
検量線から導き出した濃度(mg/ml)(③)
0.240
0.0384
0.0352
資料1g当たりのタンパク質(mg)
5.4
2.2
2.3
４） 葉緑素の定量
５） SDS-PAGE
６） PEPC抗体を用いたWestern blotting
３． 考察
４． 感想
写真 クリックで大きなサイズ。
5/30 N-
5/30 N+
6/5 N-
6/5 N+
薄層クロマトグラフィー
左が＋で右が－だったはず
SDS-PAGE
左からマーカー、＋、－、ツタ
PEPC酵素を抗体抗原反応で特異的に～
失敗してますけど。
